Laporan Mikrobiologi (Sterilisasi Alat dan Bahan)

       I.            Tujuan

Memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan sesuai untuk alat dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologiserta mampu menyiapkandan membuat media steril untuk pengujian mikrobiologi.

    II.            Teori Dasar

Sebelum melakukan percobaan dengan mikroorganisme, diperlukan proses dekontaminasi terlebih dahulu untuk meminimalisir organisme yang aktif dari suatu sistem bakteri atau virus. Upaya untuk mengeleminasi mikroba patogen dengan memanfaatkan bahan kimia yaitu antiseptik dan disinfektan, serta memanfaatkan metode disinfeksi dengan memanfaatkan energi panas. Semua metode tersebut dapat membunuh mikroba patogen kecuali endospora bakteri. Maka dari itu pemusnahan digunakan dengan cara sterilisasi, agar semua mikroba patogen dan endosporanya dapat hancur. Sterilisasi atau suci hama yaitu suatu proses membunuh segala kehidupan mikroorganisme yang ada dalam sample/contoh, alat-alat atau lingkungan tertentu. Dalam bidang bakteriologi, kata sterilisasi sering dipakai untuk menggambarkan langkah yang diambil agar memcapai tujuan untuk meniadakan atau membunuh semua bentuk kehidupan mikroorganisme. Teknik  sterilisasi dapat dibagi menjadi dua :

1.      Secara fisis

a.      Metode radiasi

Dalam mikrobiologi radiasi sinar elektromagnetik yang banyak digunakan adalah radiasi sinar ultraviolet, radiasi sinar gamma atau sinar X dan sinar matahari. Sinar matahari mengandung sinar ultraviolet , sehingga secara langsung dapat dipakai untuk proses sterilisasi. Sinar oltraviolet dapat didapat dengan mengggunakan katoda panas yaitu kedalam tabung katoda bertekanan rendah yang diiisi dengan uap  air raksa, panjang gelombang yang dihasilkan biasanya dalam orde 2500-2600 Angstrom. Lampu jalan mengandung sinar ultraviolet, tetapi sinar ultraviolet nya lebih sering diserap oleh tabung gelas yang dilaluinya, sehingga  dalam proses sterilisasi harus diperhatikan dosis  sinar ultravioletnya. Sinar ultraviolet yang diserap oleh sel organisme yang hidup, khususnya nukleotida maka elektron-elektron dari molekul  sel hidup akan mendapatkan tambahan energi. Tambahan energi tersebut dapat merubah ikatan intramolekular, seperti ikatan hidrogen dan DNA. Perubahan ikatan intramolekular tersebut dapat membunuh sel-sel tertentu. Beberapa plasma sangat peka terhadap sinar ultraviolet sehingga akan rusak. Sinar gamma memiliki kekuatan lebih besar daripada sinar  ultraviolet, merupakan radiasi pengion. Interaksi sinar gamma dengan materi biologi sangat tinggi sehingga mampu memukul elektron pada kulit atom sehingga menghasilkan pasangan ion. Cairan intraselular ataupun ekstraselular akan terionisasi sehingga menyebabakan kerusakan dan kematian pada mikroorganisme tersebut. Sterilisasi dengan sinar gamma digunakan untuk jarum suntik, stick untuk swab. Tidak boleh digunakan untuk makanan ataupun obat-obatan.

b.      Metode pemanasan dengan uap air

Pada metode pemanasan uap, alat yang digunakan yaitu autoklaf.  Benda yang akan disuci hamakan diletakkan diatas lempengan saringan dan tidak langsung mengenai air dibawahnya. Pemanasan dilakukan hingga air mendidih (kira-kira 100°C) pada tekanan 15 lb temperatur mencapai 121°C. Organisme yang tidak berspora dapat dimatikan dengan waktu 10 menit saja. Banyak spora hanya dapat mati dengan pemanasan 100°C selama 30 menit tetapi ada spora yang bertahan dalam temperatur tersebut dalam waktu berjam-jam. Spora-spora yang dapat bertahan selama 10 jam dalam temperatur 100°C dapat dimatikan dengan cara menambahkan nartrium carbonat (Na₂CO₃) dalam airnya. Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi uap ada 3 yaitu : suhu, waktu dan kelembaban.

c.      Metode pemanasan secara kering

Metode ini kurang efektif apabila temperatur kurang tinggi. Untuk mencapai keefektifan temperatur harus mencapai 160-180°C. Pada temperatur ini akan menyebabkan kerusakkan pada sel-sel hidup dan jaringan, hal ini karena adanya auto oksidasi sehingga pathogen dapat terbakar. Pada sistem pemanasan kering terdapat udara, hal ini diketahui bahwa udara merupakan penghantar panas yang buruk sehingga sterilisasi panas kering memerlukan waktu cukup lama rata-rata 45 menit. Pada temperatur 160°C memerlukan waktu 1 jam, sedangkan temperatur 180°C memerlukan waktu 30 menit. Pada metode ini yang alat-alat yang digunakan adalah alat-alat pipet, tabung reaksi, stick swab, jarum operasi, jarum suntik, syringe.

d.     Metode pemanasan secara intermittent/terputus-putus

John Tyndall (1877) memperoleh dari hasil penelitiannya bahwa temperatur didih (100°C) selama 1 jam tidak akan membunuh semua mikroorganisme tetap apabila dididihkan berulang-ulang sampai lima kali, akan membunuh mikroorganisme.

e.      Metode incineration (pembakaran langsung)

Alat-alat platina, khrome dapat disterilkan dengan cara pembakaran secara langsung pada nyala api bunsen sampai merah padam. Hanya saja lama kelamaan akan rusak tetapi keuntungannya dapat membunuh mikroba secara keseluruhan.

f.       Metode penyaringan (filtration)

Metode penyaringan berbeda dengan metode pemanasan. Pada metode pemanasan mikroba yang mati tetap berada pada material tersebut, sedangkan pada sterilisasi penyaringan mikroorgamisme tetap hidup tetap dipisahkan dengan materialnya. Bahan penyaring dibuat dari bahan porselin yang berpori dan dibuat khusus. Metode filtrasi hanya digunakan untuk sterilisasi larutan gula, cairan lain seperti serum atau sterilisasi hasil produksi mikroorganisme seperti  enzym, eksotoksin dan untuk memisahkan filtrable virus dan bakteria dari organisme lain.

g.      Strerilisasi gas

Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert, dan kereaktifannya terhadap bahan yang disterilkan harus dipertimbangkan misalnya thiamin, riboflavin, dan streptomisin kehilangan protein ketika disterilkan dengan etilen oksida. Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida. Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85°C dan 50% kelembaban relatif dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap, seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi gugus –SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba mati.
Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas.

2.      Secara kimia

Dalam sterilisasi kimia zat yang sering digunakan adalah alkohol 96%, aceton tab formalin, sulfur dioksida, dan klorin. Materi yang disuci hamakan dibersihkan terlebih dahulu kemudian direndam dalam alkohol atau aceton tab formalin.

           Bakteri dibiakan secara luas dilaboratorium fakultas  kedokteran, rumah sakit, lembaga penelitian medis, dan di Universitas serta di pabrik komersial yang menghasilkan antibiotik, zat kimia organik dan produk bakteri lain yang secara ekonomis berharga. Teknik medium padat lebih baik digunakan untuk tempat pembiakan bakteri daripada teknik lain. Medium yang digunakan dalam pembiakan bakteri harus mengandung nutrisi untuk bakteri. Nutrisi tersebut dicampur dengan agar-agar, diaduk dengan air matang hingga membentuk campuran cairan yang pekat.

 III.            Alat dan Bahan

III. 1.     Alat

-          Autoklaf

-          Oven

-          Erlenmeyer

-          Tabung reaksi

-          Cawan petri

-          Rak tabung

-          Gelas ukur

-          Pipet ukur

-          Labu takar

-          Gunting

-          Kertas label

III. 2.     Bahan

-          Benang kasur

-          Alumunium foil

-          Kertas bekas

-          Media (Nutrien agar dan Nutrien Broth)

-          Kapas

 IV.            Prosedur Kerja

Persiapan dan Sterilisasi alat

                        Alat-alat yang akan disterilkan dicuci dan dikeringkan. Ditutup alat-alat yang mempunyai mulut seperti : Tabung reaksi, Erlenmyer, Botol media, Gelas ukur, Labu takar, Pipet, dengan kapas berlemak. Cara :

-          Diambil sepotong kapas, dilipat kedua ujungnya sehingga berbentuk segi empat (besar tergantung besar mulut). Digulung kapas hingga berbentuk silinder yang cukup padat, dibungkus dengan kain kasa, kemudain dimasukkan ke dalam mulut alat (2/3 masuk dibagian mulut alat).

-          Khusus untuk pipet, tutup kapas dimasukkan dengan sebatang kawat dan kapas yang terurai keluar dari bagian mulut pipet dihilangkan dengan melewatkan mulut pada api bunsen.

-          Kapas penutup ditutup kembali dengan alumunium foil atau bahan lain yang sesuai, bila diperlukan ikat dengan benang kasur.

Alat yang permukaannya harus steril ditutup dengan alumunium foil satu per satu. Cawan petri dibungkus seluruhnya dengan kertas bekas yang bersih (bukan kertas koran). Alat-alat gelas baik yang berupa alat ukur (harus presisi) maupun bukan, disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C, selama 15-20 menit. Setelah disterilisasi dengan autoklaf dikeringkan dengan alat-alat dalam oven pengering 70°C selama 30 menit atau disimpan ditempet terbuka, untuk menghilangkan uap air yang masih tersisa.

            Pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengenceran

            Ditimbang Nutrien agar untuk pembuatan 150 ml dan Nutrien Broth untuk pembuatan 50 ml. Bobot serbuk Nutrien agar dan Nutrien Broth yang digunakan sesuaikan dengan komposisi yang tertera pada label kemasan masing-masing bahan. Dihitung berapa yang dibutukan. Dimasukkan masing-masing media yang telah ditimbang ke dalam erlenmeyer yang sudah diberi tanda (sesuai nama media). Ditambahkan aquadest lalu dipanaskan diatas nyala api bunsen sambil diaduk sampai larutan tidak keruh/jernih. Dituangkan daln botol media, lalu ditutup dengan kapas dan alumunium foil serta diikat dengan benang kasur dan diberi etiket. Disterilisasi menggunakan autoklaf. Setelah steril didinginkandi suhhu kamar, kemudian dimasukkan dalam lemari pendingin untuk disimpan. Diamati dan dicatat kondisi media. Pengamatan dilakukan 24 jam.

    V.            Data Pengamatan dan Perhitungan

M₁/V₁ = M₂/V₂

Nutrien agar  20gr/1000ml =M₂/150 ml = 3 gr

Nutrien Broth 8 gr/1000ml = M₂/50 ml  =0,4 gr

Media	Warna awal	Warna akhir
Nutrien agar	Kuning keruh	Kuning bening
Nutrien Broth	Kuning keruh	Kuning bening

 VI.            Pembahasan

Pada percobaan kali ini dilakukan sterilisasi alat-alat dan media yang akan digunakan untuk pembiakan mikroba. Tujuan sterilisasi yaitu agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba  ketika dilakukan percobaan. Sterilisasi yang digunakan adalah sterilisasi uap dengan suhu 121°C dan waktu yang digunakan 20 menit. Digunakan sterilisasi uap, karena alat-alat tidak akan rusak atau memuai khususnya untuk alat-alat ukur pada suhu 121°C. Alat-alat seperti erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, pipet ukur, cawan petri, labu ukur dimasukkan kedalam alat yang disebut dengan autoklaf. Sebelum dimasukkan kedalam autoklaf alat-alat yang memiliki mulut diberi kapas berlemak dan kain kasa agar alat-alat dapat benar-benar steril dari mikroba. Kemudain dibalut dengan kertas dan alumunium foil agar ketika telah disterilisasi (keluar dari autoklaf) tidak terkontaminasi kembali oleh miroba. Pada sterilisasi uap, alat-alat diletakkan dalam saringan agar tidak mengenai air yang berada dipermukaan autoklaf, dilakukan pemanasan pada autoklaf terlebih dahulu sampai suhu air tepat 100°C pada tekan 1,5 kg/cm² . Cara pengaturan tekanan dengan cara membuka tutup pada autoklaf. Karena suhu akan naik terus menerus bila penutup tidak terbuka.

Dilakukan sterilisasi bahan agar bahan yang digunakan bener-bener steril, apabila tidak disterilkan terlebih dahulu mungkin saja akan terjadi kontaminasi oleh bakteri lain yang akan mempersulitkan dalam pengamatan bakteri yang seharusnya diamati. Pada peercobaan ini nutrien yang digunakan untuk pembiakan mikroba yaitu nutrien agar dan nutrien Broth dimana media ini diencerkan terlebih dahulu dengan aquadest dan dilakukan pemanasan untuk mempermudah pencampuran. Nutrien Agar adalah medium umum untuk uji air dan produk pangan. Nutrien juga digunakan untuk pertumbuhan dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak daging, pepton dan agar. Lalu Nutrien Broth adalah media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Kegunaan dari Nutrien Broth tidak jauh berbeda dengan Nutrien Agar. Pada percobaan kali ini membutuhkan nutrient agar yang di pakai sebanyak 3 gram dan nutrient broth sebanyak 0,4 gram dilarutkan sampai 50 ml aquadest dan masing – masing dipanaskan pada suhu 100 – 125 C. Mulut erlenmeyer diberi kapas yang dibatul oleh kain kasa dan dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan.

VII.            Kesimpulan

1.      Sterilisasi adalah proses penghancuran seluruh mikroba hidup dengan spora-sporanya.

2.      Sterilisasi uap menggunakan uap air dan tekanan sebagai penstesilnya.

3.      Prinsip penggunaan autoclave di dasarkan pada mikroorganisme termasuk spora yang tahan panas, mudah terbunuh dengan panas lembab pada temperatur sedikit di atas titik didih air.

4.      Media Nutrien Agar dan Nutrien Broth hasil yang diperoleh tidak terdapat bakteri maupun jamur di karenakan alat-alat yang dipakai masih steril

VIII.            Daftar Pustaka

Darmadi. 2008. Infeksi Nosokimial Problematika dan Penyelesaiannya .Salemba Merdeka. Jakarta.

Gabriel ,J.F.1996.Fisika Kedokteran. Buku Kedokteran EGC.Jakarta.

Setiowati, Tetty. Furqonita, Deswanty.2007. Biologi Intensif Jilid 1untuk SMA/MA Kelas X. Azka Press.Jakarta.